ProAqa親和色譜柱是設(shè)計(jì)用于HPLC和FPLC系統(tǒng)的高流速高壓色譜柱。其固定相采用平均粒徑為20 µm的多孔聚乙烯二乙烯基苯（PS/DVB）為基質(zhì)，表面鍵合一層親水涂層，涂層上以化學(xué)鍵合的方式連接了蛋白質(zhì)A，蛋白質(zhì)A可結(jié)合除IgG3之外的含F(xiàn)c片段的免疫球蛋白。該色譜柱可用于抗體和融合蛋白（可特異性結(jié)合重組蛋白A）的定量和小規(guī)模純化。

Figure 1.抗體樣品在ProAqa 2.1×30 mm柱上的穿透曲線(Mab 321 from Sepax Technologies, Inc.) 。流動(dòng)相：磷酸鈉緩沖溶液，0.1M, pH 7.4, NaCl, 0.15M, 0.15mg/mL Mab 321；流速：2.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm

技術(shù)參數(shù)

空白運(yùn)行

    必須使用高純度的緩沖鹽，并在使用前過(guò)濾(0.22 or 0.45 μm)所有的緩沖溶液。

    上樣前，必須執(zhí)行空白運(yùn)行，并監(jiān)測(cè)本底。為了減小結(jié)合和洗脫緩沖溶液之間變化產(chǎn)生的基線變化，建議使用：     
(a) 50 mM磷酸鹽 pH 7, 0.15 M NaCl 作為起始/淋洗緩沖溶液，以及 
(b) 0.1% (12 mM) HCl 0.15 M NaCl 作為洗脫緩沖液。

    以上是最有效的淋洗/洗脫系統(tǒng)，產(chǎn)生的基線波動(dòng)最小。如果要求洗脫樣品保留生物活性，不建議使用鹽酸(HCl)，因?yàn)辂}酸會(huì)使抗體變性。

樣品的準(zhǔn)備和上樣

    為了確保樣品的有效結(jié)合和避免色譜柱篩板被污染，一般按照以下方式來(lái)準(zhǔn)備樣品：
(a) 將樣品溶解到或溶劑替換為起始/淋洗緩沖液，這對(duì)于大體積樣品尤為重要(超過(guò)25%的柱體積)。
(b) 進(jìn)樣前離心或過(guò)濾樣品 (0.22 或0.45 μm)。
(c) 對(duì)血清樣品進(jìn)行熱處理（置于56 °C 下30分鐘）以去除會(huì)堵塞色譜柱的纖維蛋白原。
(d) 對(duì)樣品進(jìn)行去脂處理，因?yàn)橹悤?huì)對(duì)色譜柱產(chǎn)生不可逆的污染。
(e) 所有樣品使用前應(yīng)該用0.45 μm或0.2 μm濾膜過(guò)濾。

    為了確保樣品的有效結(jié)合和避免填料與色譜柱被污染，需要對(duì)樣品載量進(jìn)行測(cè)定： 
(a) ProAqa 動(dòng)態(tài)結(jié)合載量見(jiàn)“描述”。
(b) 其它抗體的結(jié)合載量取決于抗體來(lái)源與所屬子類以及所使用的配體。但是一般會(huì)低于“描述”中IgG的載量。
(c) 當(dāng)作為分析用途時(shí)，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)線性曲線測(cè)定最小和最大上樣量。

起始/淋洗緩沖液

(a) 絕大多數(shù)情況下，使用簡(jiǎn)單的緩沖鹽如10 ~ 50 mM 磷酸鹽或Tris。
(b) 起始/淋洗緩沖液的pH范圍可在6.0到9.0之間，但需注意當(dāng)pH最高的時(shí)候結(jié)合力最強(qiáng)。
(c) 加入一些鹽 (0.1到0.2 M 的NaCl或KCl) 以防止因蛋白/蛋白相互作用引起的非特異性吸附。

洗脫條件

    如果色譜柱作為分析用途，洗脫緩沖液為含25-100 mM 磷酸鹽，pH為 2.0-3.5，含0-150 mM氯化鈉的溶液。其它可能會(huì)用到的洗脫緩沖鹽組分包括鹽酸、甘氨酸、檸檬酸、乙酸或其它可調(diào)低pH的組分。

    如果色譜柱作為制備用途，可采用以下條件。 
(a) 對(duì)于絕大多數(shù)抗體的洗脫，可將pH降至2-3，常用緩沖體系包括磷酸鹽、乙酸鹽、鹽酸和甘氨酸。根據(jù)緩沖體系的不同，緩沖鹽濃度為6-100 mM或2-20% (v/v)。
(b) 可用含0.15 M NaCl的6-12 mM HCl來(lái)獲得理想的pH范圍，并將基線波動(dòng)降到最低程度。 
(c) 由于抗體會(huì)因其種類和所屬子類的不同而表現(xiàn)出不同的結(jié)合/洗脫行為，最佳的洗脫條件需要通過(guò)經(jīng)驗(yàn)性地測(cè)定。

例1 單克隆抗體在ProAqa色譜柱上的洗脫